Tau-Tubulinkinase 1 und 2 regulieren die Ciliogenese und menschliche pluripotente Stammzellen

Aug 28, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12884 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Primäre Zilien sind wichtige Regulatoren der Embryonalentwicklung und der Gewebehomöostase. Ihre Mechanismen und Funktionen, insbesondere im Kontext menschlicher Zellen, sind jedoch noch unklar. Hier analysierten wir die Folgen der primären Zilienmodulation für die Proliferation und Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs). Wir berichten, dass weder die Aktivierung des Zilien-assoziierten Hedgehog-Signalwegs noch die Ablation primärer Zilien durch CRISPR-Genbearbeitung zur Ausschaltung von Tau Tubulin Kinase 2 (TTBK2), einem entscheidenden Ciliogeneseregulator, die Selbsterneuerung von hPSCs beeinflusst. Darüber hinaus zeigen wir, dass TTBK1, eine verwandte Kinase ohne vorherige Verbindung zur Ciliogenese, während der Differenzierung neuronaler Rosetten aus hPSCs hochreguliert wird. Wichtig ist, dass wir zeigen, dass TTBK1 zwar nicht in der Mutterzentriole lokalisiert werden kann, aber die primäre Zilienbildung in den differenzierten, nicht jedoch in den undifferenzierten hPSCs reguliert. Schließlich zeigen wir, dass TTBK1/2 und primäre Zilien an der Regulierung der Größe von hPSCs-abgeleiteten Nervenrosetten beteiligt sind.

Zilien sind haarähnliche Organellen, die aus der Oberfläche der meisten Zellen herausragen. Während die beweglichen Zilien möglicherweise die ältesten jemals bekannten Organellen sind1, war die Funktion der einzelnen unbeweglichen primären Zilien lange Zeit rätselhaft. Mittlerweile ist bekannt, dass das primäre Cilium Rezeptoren und Effektoren verschiedener Signalwege enthält, beispielsweise des Hedgehog-Signalwegs (HH)2,3. Umgekehrt steuern primäre Zilien wichtige Aspekte der Embryonalentwicklung und der Gewebehomöostase3,4. Defekte im Aufbau und in der Funktion der primären Zilien verursachen Krankheiten wie das Bardet-Biedel-Syndrom, das Joubert-Syndrom oder die Nephronophthisis, die zusammenfassend als Ziliopathien bezeichnet werden5. Der Zilienstatus wirkt sich auch auf bestimmte Krebsarten aus, beispielsweise auf das Medulloblastom oder das Basalzellkarzinom6. Daher kann die gezielte Behandlung von Cilium-bezogenen Signalwegen eine günstige therapeutische Strategie darstellen.

Das ausgewachsene primäre Zilium besteht aus dem vom Mutterzentriolen abgeleiteten Basalkörper, der Übergangszone und dem auf Mikrotubuli basierenden Axonem, das in einer Ziliarmembran eingeschlossen ist7. Der Zilienaufbau wird am distalen Ende des Mutterzentriols durch die koordinierte Wirkung distaler Gliedmaßenkomponenten (wie CEP83 und CEP164) und der Tau-Tubulin-Kinase 2 (TTBK2) initiiert8,9,10,11. Die Aktivität der TTBK2-Kinase ist für die Ziliogenese essentiell – in Zellen ohne aktive Kinase werden keine Zilien gebildet. Nach der Abgabe und dem Andocken von Vesikeln an die distalen Anhängsel werden Komponenten des Intraflagellaren Transports (IFT) in einer TTBK2-abhängigen Weise rekrutiert8,10, um das Wachstum des Zilienaxonems durch den Transport verschiedener Ladungen zwischen der Zilienbasis und der Zilienspitze zu erleichtern12. Bemerkenswert ist, dass für TTBK1 noch keine Hinweise auf eine Rolle bei der Zilienbildung vorliegen, da seine Kinasedomäne der von TTBK213 sehr ähnlich ist.

Der Hedgehog-Signalweg ist vielleicht der am besten charakterisierte Signalweg, der auf primären Zilien beruht. In Abwesenheit des HH-Liganden lokalisiert sich der Patched-Rezeptor (PTCH) im primären Zilien und verhindert die Ziliarakkumulation des Smoothened-Rezeptors (SMO). Die Bindung des HH-Liganden an PTCH löst die Entfernung von PTCH aus den Zilien aus, was wiederum zur Akkumulation von SMO in den Zilien führt. SMO interagiert dann mit Cholesterin im Zilium, um die Verarbeitung von GLI von seiner repressiven Form (GLI-R) auf die aktive Form (GLI-A) umzustellen. Sowohl GLI-R als auch GLI-A werden von primären Zilien in den Zellkern transloziert, um HH-Zielgene zu unterdrücken bzw. zu induzieren2,4,14. Die von HH regulierten Transkripte umfassen Komponenten des Signalwegs (z. B. PTCH1, GLI1) sowie Transkriptionsfaktoren, die die Proliferation und Entscheidungen über das Zellschicksal regulieren3.

Der HH-Signalweg spielt eine herausragende Rolle bei der neuronalen Entwicklung. Seine Aktivität ist entscheidend für die Bildung der Bodenplatte (die Quelle des HH-Liganden im ventralen Teil des Neuralrohrs) und die Spezifizierung einzelner neuronaler Typen15,16. Dieser Aktivität stehen WNT/Beta-Catenin- und BMP-Wege entgegen. Somit resultiert die Bildung des Neuralrohrmusters aus gegenläufigen Aktivitäten von HH, WNT und BMP, die sowohl räumlich als auch zeitlich reguliert werden17,18. Darüber hinaus treibt die HH-Signalübertragung die Zellproliferation während der neurologischen Entwicklung bei Mäusen voran19 und kann die Zellteilung sowohl bei neuronalen als auch bei nicht-neuralen Zelltypen fördern20,21.

Ein großes Hindernis für das Verständnis der Rolle der primären Cilium- und Cilium-assoziierten Signalwege war das Fehlen eines geeigneten zellulären Systems zur Modellierung menschlicher Phänotypen und Mechanismen. Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs), zu denen embryonale Stammzellen (ESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) gehören, können sich selbst erneuern und in alle Zelltypen des menschlichen Körpers differenzieren22,23. Folglich sind sie vielversprechend für die Modellierung sowohl physiologischer als auch pathophysiologischer Aspekte der menschlichen Embryogenese „in einer Schale“24,25. Interessanterweise können undifferenzierte hPSCs primäre Zilien zusammenbauen und Komponenten des HH-Signalwegs exprimieren26,27,28. Bei Mäusen beginnen nach der Einnistung des Embryos primäre Zilien im Epiblast zu erscheinen29. Die Bedeutung primärer Zilien für die Selbsterneuerungs- oder Differenzierungsfähigkeiten von hPSCs ist jedoch unvollständig geklärt, und in der Literatur gibt es Widersprüche. Während primäre Zilien als Instrument für die neuronale Differenzierung von hPSCs30 vorgeschlagen wurden, führt ihre Ablation, entweder in Mausembryos oder in hPSCs, zu überraschend subtilen neuronalen Differenzierungsdefekten31,32.

Ereignisse der neuralen Differenzierung und Neuralrohrentwicklung können mithilfe von hPSCs abgeleiteter neuraler Rosetten, Ansammlungen radial organisierter Neuroepithelzellen mit einem zentralen Lumen, modelliert werden33,34. Die neuronalen Rosetten, die typischerweise frühe neuronale Marker wie SOX2 und PAX6 exprimieren, können leicht in einzelne regionalspezifische neuronale Subtypen spezifiziert werden und dienen auch als Vorläufernische35,36,37. Der HH-Signalweg ist zusammen mit dem Notch-Signal an der Aufrechterhaltung neuronaler Rosetten beteiligt33.

Hier kombinieren wir die pharmakologische Aktivierung des HH-Signalwegs mit der CRISPR/Cas9-vermittelten Ablation von TTBK2, um die Rolle primärer Zilien bei der Proliferation und neuronalen Differenzierung von hPSCs zu untersuchen. Wir zeigen, dass TTBK2 und primäre Zilien zwar nicht für die Selbsterneuerung von hPSCs erforderlich sind, primäre Zilien und HH-Signale jedoch die Größe der von hPSCs abgeleiteten neuronalen Rosetten regulieren. Darüber hinaus identifizieren unsere Daten eine unerwartete Rolle von TTBK1 im Cilium-Assemblierungsweg.

Um die Rolle der primären Zilien-bezogenen HH-Signalübertragung in hPSCs (menschlichen pluripotenten Stammzellen) zu untersuchen, behandelten wir die CCTL14-hPSC-Linie mit Smoothened Agonist (SAG) (5 nM, Tag (D)1–9) während der Differenzierung neuronaler Rosetten (Abb. 1A). Zunächst beobachteten wir in Übereinstimmung mit einem früheren Bericht27, dass ARL13B-positive primäre Zilien aus der apikalen Zelloberfläche (Lumen) der Neuralrosette herausragten (Abb. 1B). Als nächstes stellten wir fest, dass die SAG-Behandlung zu einer Induktion der mRNA-Expression der HH-Zielgene GLI1 und PTCH1 führte (Abb. 1C). Im Gegensatz dazu zeigten SAG- oder scheinbehandelte Rosetten die erwarteten Veränderungen der mRNA-Werte der Pluripotenz- (NANOG, OCT4) und Differenzierungsmarker (PAX6 und ISL1) gegenüber der undifferenzierten Kontrolle, SAG hatte jedoch keinen nennenswerten Einfluss auf die Expression eines dieser Hersteller (Suppl. Abb. 1A).

Die HH-Signalisierung erhöht die Größe neuronaler Rosetten. (A) Experimentelles Design von Experimenten zur Frühphasendifferenzierung neuronaler Rosetten. Die Zellen wurden auf D0 ausgesät, die SAG-Behandlung begann auf D1 und die Kulturen wurden auf D9 analysiert. (B) Repräsentatives Bild der Zilien-IF-Färbung in der Frühphase der Differenzierung von CCTL14-Rosetten auf D9, ARL13B-Färbung wurde zum Nachweis primärer Zilien verwendet, γ-TUBULIN-Färbung zeigt Zentriolen an; Maßstabsbalken = 20 µm. (C) SHH-Zielgen-GLI1- und PTCH1-mRNA-Expression (qRT-PCR) in schein- und SAG-behandelten CCTL14-Rosetten in der frühen Phase der Differenzierung (D9); n = 5, t-Test. (D) Experimentelles Design neuronaler Rosetten, später Phasendifferenzierungsexperimente. D0 – Beginn des Experiments, D9 – Flecken neuraler Rosetten wurden in eine frische Kulturplatte übertragen, D10 – Beginn der täglichen SAG-Behandlung, D15/20 – Analyse. (E) Repräsentative Bilder von schein- oder SAG-behandelten CCTL14-Rosetten im Spätstadium der Differenzierung auf D15 im Phasenkontrast (oben) und IF (unten), PAX6-Färbung wurde verwendet, um die laufende neurale Differenzierung zu zeigen, ZO1-Färbung zeigt Polarisation im Lumen von neural an Rosetten; Maßstabsbalken = 100 µm. (F) Messung der Rosettenfläche in schein- oder SAG-behandelten CCTL14-Rosetten im Spätstadium der Differenzierung auf D15; n = 3, t-Test. (G) Repräsentative Bilder von Schein- oder SAG-stimulierten Neo1-Rosetten im späteren Stadium der Differenzierung auf D15 im Phasenkontrast; Maßstabsbalken = 100 µm. (H) Messung der Rosettenfläche in schein- oder SAG-behandelten Neo1-Rosetten im Spätstadium der Differenzierung auf D15; n = 4, t-Test.

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen der Aktivierung des HH-Signalwegs in einem späteren Stadium der Differenzierung neuronaler Rosetten. Zu diesem Zweck haben wir Flecken von CCTL14-abgeleiteten Nervenrosetten auf D9 präpariert und sie in Gegenwart von SAG/Vehikel bis D15 oder D20 kultiviert (Abb. 1D). Auf D15 exprimierten Zellen, die die Rosetten bilden, den neuronalen Maker PAX6 und zeigten erwartungsgemäß ein stark angereichertes Tight-Junction-Protein ZO-1 an der apikalen Membran (Abb. 1E)38. In Übereinstimmung mit der Rolle des HH-Signalwegs bei der Neuralrohrstrukturierung18 beobachteten wir nach der SAG-Behandlung auch eine erhöhte Expression von SHH-mRNA und eine verringerte Expression von WNT1-mRNA (Suppl. Abb. 1B). Interessanterweise stellten wir fest, dass die mit SAG behandelten Rosetten deutlich größer waren als ihre scheinbehandelten Kontrollen (Abb. 1E, F). Wichtig ist, dass wir die Wirkung der SAG-Behandlung auf die Größe der Nervenrosette mithilfe der iPSC-Linie Neo1 bestätigt haben (Abb. 1G, H). Zusammenfassend bestätigen und erweitern unsere Daten die frühere Beobachtung eines positiven Effekts der Aktivierung des HH-Signalwegs auf die Größe neuraler Rosetten33.

Nachdem wir unser Modellsystem validiert hatten, verwendeten wir die CRISPR-Genbearbeitung, um TTBK2-Knockout (KO) in CCTL14-hPSCs zu etablieren. Wir stellten die Hypothese auf, dass TTBK2-Null-hPSCs keine primären Zilien aufweisen sollten. In Übereinstimmung damit beobachteten wir, dass WT (scheintransfizierte) hPSCs in etwa 50 % der Zellen ARL13B + primäre Zilien bildeten, während mit TTBK2-gRNA transfizierte hPSCs (wir nannten diese gemischte Zellpopulation „TTBK2 niedrig“) eine deutliche Verringerung der Zilienbildung zeigten ( Abb. 2A). Im Gegenzug isolierten wir einzelne klonale Linien. Zunächst haben wir überprüft, dass CRISPR-Cas9 den ORF des TTBK2-Locus in Exon 4, der einen Teil der Kinasedomäne kodiert, erfolgreich stört (Abb. 2B und ergänzende Abb. 2A). Insgesamt erhielten wir 4 TTBK2 KO- und 3 WT-Gegenstücke (WT1- und WT2-Klone stammten aus einer scheintransfizierten Population, während WT3 einen „uneditierten“ Klon darstellt, der aus der „TTBK2 low“-Mischpopulation isoliert wurde), die wir im Folgenden als Kontrollen verwendeten Experimente. Bemerkenswert ist, dass wir auch eine heterozygote Linie erhalten haben, bei der ein Allel gestört war und das andere eine In-Frame-Deletion innerhalb der Kinasedomäne enthielt (Suppl. Abb. 2A), die wir TTBK2-„Mutante“ (TTBK2 MUT) nannten. Als nächstes bestätigten wir das Fehlen nachweisbarer Mengen an TTBK2-Protein im gesamten Zelllysat (Suppl. Abb. 2B) und am Mutterzentriol in TTBK2 KO/MUT-Linien (Abb. 2C und Suppl. Abb. 2C). Wichtig ist, dass die Linien ohne TTBK2-Expression keine ARL13B + primären Zilien bilden konnten (Abb. 2C, E und ergänzende Abb. 2C).

TTBK2 ist für die Ciliogenese von entscheidender Bedeutung, für die Selbsterneuerung in hPSCs jedoch entbehrlich. (A) Prozentsatz der Zellen mit ARL13B + primärem Cilium in WT-Populationen (scheintransfiziert) und „TTBK2-niedrig“-Populationen von CCTL14-hPSCs. 40 Zellen pro Bild aus 6 Bildern, die für jede Bedingung analysiert wurden. (B) Schematische Darstellung der TTBK2-Exon-4-Sequenzdetails in repräsentativen WT- und TTBK2-CRISPR-Zelllinien, lila = Insertion/Deletion. (C) Repräsentative Bilder des IF-Nachweises von TTBK2 (oben) und des Vorhandenseins von Zilien (unten; sichtbar gemacht durch ARL13B-Färbung) in undifferenziertem WT und TTBK2 KO; γ-TUBULIN-Färbung wurde zum Nachweis von Zentriolen verwendet; Maßstabsbalken = 5 µm. (D) Repräsentative Bilder der Koloniemorphologie undifferenzierter Zellen in WT1 und TTBK2 KO1. (E) Prozentsatz der Zellen mit ARL13B + primärem Cilium in einzelnen klonalen Zelllinien. 20 Zellen in 1–3 ROIs pro Bild aus 2–3 Bildern für jeden Zustand wurden analysiert. (F) Vergleich des relativen Wachstums der angegebenen undifferenzierten WT- und TTBK2-KO-Linien, bewertet durch Messung der Kristallviolettabsorption; als Kontrolle wurde eine Behandlung mit Centrinon verwendet, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie die Proliferationskapazität beeinträchtigt; n = 3. (G) mRNA-Expression (qRT-PCR) der Pluripotenzmarker NANOG und OCT4 in undifferenziertem WT1 und TTBK2 KO1. Als Referenz wurde das in neurale Rosetten differenzierte parentale CCTL14 einbezogen; n = 4, einfache ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Holm-Sidak.

Sowohl TTBK2 WT- als auch TTBK2 KO/MUT-hPSCs wuchsen in flachen, glattkantigen Kolonien mit prototypischer hPSC-Morphologie (Abb. 2D, ergänzende Abb. 2D), die stabil und selbsterneuernd blieben, ohne erkennbare Anzeichen einer spontanen Differenzierung im Laufe der Zeit 20 + Passagen. In Übereinstimmung damit stellten wir fest, dass die Abreicherung von Zentriolen durch die Behandlung mit Centrinon (150 nM)39,40 zwar die Proliferationskapazität von hPSCs erheblich beeinträchtigte, die Ablation von TTBK2/primären Zilien jedoch keinen solchen Effekt zeigte (Abb. 2F und Supp. Abb. 2E). ). Darüber hinaus exprimierten TTBK2 WT und KO vergleichbare Werte der Pluripotenzmarker OCT4 und NANOG (Abb. 2G und ergänzende Abb. 2B und F). In ähnlicher Weise fanden wir keine Auswirkung der SAG-Behandlung auf die Proliferation von CCTL14- und Neo1-hPSCs (Suppl. Abb. 2G, H), die Expression der Pluripotenzmarker OCT4 und NANOG (Suppl. Abb. 2I, J) und den Proteinspiegel von OCT4 (Ergänzende Abb. 2K). Diese Ergebnisse bestätigen und erweitern aktuelle Beobachtungen zur Beziehung zwischen primären Zilien und Selbsterneuerung32,41 und legen nahe, dass TTBK2 und primäre Zilien für die Selbsterneuerung von hPSCs entbehrlich sind.

Primäre Zilien sind für die korrekte Aktivität sowohl der positiven als auch der negativen HH-Signalwegregulatoren erforderlich3. Infolgedessen zeigen primäre Zilienmutanten bei einigen Zelltypen einen Funktionsverlust der HH-Phänotypen und bei anderen einen Funktionsgewinn der HH-Phänotypen4. Vor diesem Hintergrund haben wir gefragt, welche spezifische Funktion TTBK2/primäre Zilien bei der Regulierung der Größe von hPSC-abgeleiteten Nervenrosetten haben. Zu diesem Zweck haben wir das zuvor verwendete Protokoll übernommen (Abb. 1D). Zunächst bestätigten wir, dass TTBK2 in den Mutterzentriolen fehlte (Suppl. Abb. 3) und die primäre Zilienbildung in TTBK2 KO-Neuralrosetten beeinträchtigt war (Abb. 3A, B). Als nächstes stellten wir fest, dass sowohl die WT- als auch die KO-TTBK2-Linie in der Lage waren, effizient neurale Rosetten zu bilden, die PAX6 exprimierten, wobei ZO-1 an der apikalen Membran rekrutiert wurde (Abb. 3C, D). Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass die Nervenrosetten bei scheinbehandelten TTBK2-KOs deutlich größer waren als bei den entsprechenden WT-Kontrollen. Darüber hinaus förderte die SAG-Behandlung zwar die Vergrößerung der Rosette bei WT, zeigte jedoch keinen additiven Effekt bei TTBK2 KO (Abb. 3D, E). Als nächstes fragten wir, ob eine veränderte Zellproliferation die beobachteten Auswirkungen auf die Größe der Nervenrosette erklären könnte. Zu diesem Zweck untersuchten wir die Anzahl der Phosphohiston 3 (pH3)-positiven Zellen in neuralen Rosetten auf D15. Tatsächlich stellten wir fest, dass die relative Anzahl der pH3 + -Zellen in TTBK2-KO- bzw. MUT-Zellen erhöht war (Abb. 3F, G).

Ein Mangel an TTBK2 erhöht die Größe der Nervenrosetten. (A) Repräsentative Bilder der IF-Erkennung primärer Zilien (visualisiert durch ARL13B-Färbung) in WT1- und TTBK2-KO1-abgeleiteten Nervenrosetten bei D9 (oben) und D15 (unten). γ-TUBULIN wurde verwendet, um Zentriolen anzuzeigen; Maßstabsbalken = 20 µm. (B) Relative Ziliation (gemessen als ARL13B-positiver Rosettenflächenanteil) in WT1- oder TTBK2-KO1-abgeleiteten neuralen Rosetten bei D9 und D15; n = 2, einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Holm-Sidak. (C) Mock- oder SAG-behandelte WT1-abgeleitete Nervenrosetten, visualisiert im Phasenkontrast (oben) oder IF (unten). Die PAX6-Färbung wurde verwendet, um die laufende neuronale Differenzierung zu überwachen, die ZO1-Färbung visualisiert die Polarisation des Lumens; Maßstabsbalken = 50 µm. (D) Schein- oder SAG-behandelte TTBK2 KO1-abgeleitete Nervenrosetten, visualisiert im Phasenkontrast (oben) und IF (unten), PAX6-Färbung wurde verwendet, um die laufende neurale Differenzierung zu überwachen, ZO1-Färbung visualisiert die Polarisation des Lumens; Maßstabsbalken = 50 µm. (E) Messung der Rosettenfläche in schein- oder SAG-behandelten WT- bzw. TTBK2-KO-abgeleiteten Nervenrosetten auf D15; n = 3, einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Holm-Sidak. (F) Repräsentative Bilder des Phospho-histon3 (pH3) IF-Nachweises unter den angegebenen Bedingungen auf D15; Maßstabsbalken = 20 µm. (G) Relative Proliferation als Verhältnis der Anzahl pH3-positiver Zellen pro Rosettenfläche auf D15; n = 3, einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Holm-Sidak.

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass TTBK2 und primäre Zilien zwar für die Reaktion auf die HH-Signalwegstimulation in Nervenrosetten erforderlich sind, ihre Ablation jedoch den Phänotyp der HH-Signalwegaktivierung nachahmt. Da wir jedoch nicht in der Lage waren, den Status der Aktivierung des HH-Signalwegs bei der Differenzierung neuronaler WT- und TTBK2-KO-Rosetten eindeutig zu bestimmen, ist ein Beitrag anderer Signalwege zum Phänotyp der Rosettengröße formal möglich.

Unsere Daten zeigten, dass TTBK2 für die Ziliogenese in undifferenzierten hPSCs unverzichtbar ist (Abb. 2B, ergänzende Abb. 2C), in Übereinstimmung mit seiner Rolle bei der Bildung primärer Zilien in anderen biologischen Systemen 8, 42. Überraschenderweise zeigten unsere Daten auch, dass sich auch bei Abwesenheit von TTBK2 (Suppl. Abb. 3) immer noch einige primäre Zilien mit der fortschreitenden Differenzierung von TTBK2-KO-abgeleiteten Neuralrosetten bildeten (Abb. 3A), wenn auch mit einer deutlich geringeren Rate WT (Abb. 3B). Wir stellten die Hypothese auf, dass das Fehlen von TTBK2 insbesondere während der neuronalen Differenzierung teilweise behoben werden könnte. Im Gegenzug betrachteten wir Tau-Tubulinkinase 1 (TTBK1) als plausiblen Mediator eines solchen Rettungseffekts. Wie bereits erwähnt, hatte TTBK1 keine früheren Verbindungen zur Regulierung der Ciliogenese, teilte jedoch einen hohen Grad an Sequenzhomologie in seiner Kinasedomäne mit TTBK2 (Suppl. Abb. 4C) und zeigte hohe Expressionsniveaus im ZNS13.

Zunächst untersuchten wir die Expression von TTBK1 und stellten fest, dass seine mRNA-Spiegel in differenzierenden CCTL14-hPSC-abgeleiteten neuronalen Rosetten (Abb. 4A) sowie in neurodifferenzierten Kulturen und Organoiden von i3N-iPSCs (Suppl. Abb. 4A) signifikant hochreguliert waren. Als nächstes verwendeten wir den TTBK1/2-Inhibitor41 (1 µM) während der neuronalen Rosettendifferenzierung (D12-15) von TTBK2 WT bzw. KO hPSCs. Wir fanden heraus, dass die Behandlung nicht nur die Zilienbildung bei TTBK2 WT reduzierte, sondern auch die Zilienbildung bei TTBK2 KO fast vollständig eliminierte (Abb. 4C). Wichtig ist, dass die Hemmung von TTBK1/2 zu einer zusätzlichen Vergrößerung der Rosettengröße bei TTBK2 KO führte (Abb. 4D). Um diese Beobachtung zu bestätigen, exprimierten wir vorübergehend TTBK1-Halo in TTBK2-KO-hPSCs und hTERT-RPE-1-TTBK2-KO-Zellen. Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass GFP-TTBK2 zwar vorübergehend in Basalkörperchen exprimiert wurde, TTBK1-Halo dies jedoch nicht konnte, seine Expression jedoch teilweise die Bildung von ARL13b + primären Zilien in TTBK2-KO-Zellen unterstützte. Während die Transfektion und damit der Rettungseffekt von TTBK1/2 auf die Zilienbildung (Abb. 4E, ergänzende Abb. 4B) in TTBK2-KO-hPSCs eher ineffizient waren, war die Rettung in TTBK2-KO-hTERT-RPE-1-Zellen ausgeprägter. Hier rettete die transiente Expression von TTBK1-Halo die Ciliogenese in etwa 10 % der Zellen, während GFP-TTBK2 die Bildung primärer Zilien in etwa 15 % der transfizierten Zellen unterstützte (Abb. 4G). Zusammenfassend legen diese Daten nahe, dass TTBK1 an der Regulierung der primären Zilienanordnung beteiligt ist und dass die Ziliogenese in hPSC-abgeleiteten Nervenrosetten sowohl von TTBK1 als auch von TTBK2 kontrolliert wird, wobei TTBK2 wahrscheinlich eine wichtigere Rolle spielt.

Tau-Tubulinkinase 1 (TTBK1) reguliert die Zilienbildung. (A) mRNA-Expression (qRT-PCR) von TTBK1 in der undifferenzierten Elternzelllinie CCTL14 und von WT1 oder TTBK2 KO1 abgeleiteten neuralen Rosetten auf D15; n = 2–3, einfaktorielle ANOVA mit Holm-Sidaks Mehrfachvergleichstest. (B) IF-Nachweis primärer Zilien (visualisiert durch ARL13B-Färbung) in mit Schein- oder TTBK1/2-Inhibitor behandelten WT1 bzw. TTBK2 KO1 auf D15, γ-TUBULIN wurde zum Nachweis von Zentriolen verwendet; Maßstabsbalken = 50 µm. (C) Relative Ziliation (gemessen als ARL13B-positiver Rosettenflächenanteil) in WT1- oder TTBK2-KO1-abgeleiteten Neuralrosetten, wie angegeben behandelt, auf D15; n = 2, einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Holm-Sidak. (D) Messung der Rosettenfläche in von WT1 oder TTBK2 KO1 abgeleiteten neuronalen Rosetten, wie angegeben behandelt, auf D15; n = 2, einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Holm-Sidak. (E) IF-Nachweis von primären Zilien (visualisiert durch ARL13B-Färbung) in TTBK2 KO1, transfiziert mit TTBK1-Halo (links) oder nicht transfiziert (rechts). Die CETN1-Färbung wurde zum Nachweis von Zentriolen verwendet. Maßstabsbalken = 5 µm. (F) IF-Nachweis von primären Zilien (visualisiert durch ARL13B-Färbung) in hTERT RPE-1 TTBK2 KO-Zellen, die mit TTBK1-Halo (links) transfiziert oder nicht transfiziert (rechts) waren, CETN1 wurde verwendet, um Zentriolen anzuzeigen; Maßstabsbalken = 5 µm. (G) Zusammenfassung des Rettungseffekts der TTBK1- oder TTBK2-Expression in hTERT RPE-1 TTBK2 KO auf die Ciliogenese; n = 3, einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Holm-Sidak.

Sowohl primäre Zilien als auch Stammzellen haben sich als Schlüsselregulatoren der Embryonalentwicklung und der Gewebehomöostase herausgestellt. Hier haben wir die Funktionen primärer Zilien anhand einer Gruppe von WT- und CRISPR/Cas9-editierten hPSCs ohne TTBK2 und damit wiederum primärer Zilien untersucht. Während wir keine wesentliche Funktion von TTBK2/primären Zilien bei der Selbsterneuerung von hPSCs fanden, identifizierten wir eine Rolle der primären Zilien und des HH-Signalwegs bei der Regulierung von hPSCs abgeleiteten neuralen Rosetten. Darüber hinaus weisen unsere Daten darauf hin, dass TTBK1 an der Regulierung der Ciliogenese in menschlichen Zellen beteiligt ist (Abb. 5).

Grafische Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse. Die Ablation von TTBK2 in hPSCs verhindert die Bildung primärer Zilien, die durch die Expression von TTBK1 gerettet werden können. Die ablatierte Ciliogenese oder die SAG-vermittelte Aktivierung des HH-Signalwegs hat keinen Einfluss auf die Selbsterneuerung von hPSCs. Die Entfernung von TTBK2/primären Zilien erhöht die Größe der Nervenrosetten während der neuronalen Differenzierung von hPSCs, ähnlich dem Effekt der Aktivierung des HH-Signalwegs.

Über primäre Zilien, die das HH-Signal weiterleiten können, wurde bereits früher in hPSCs berichtet, allerdings mit unklarer biologischer Bedeutung26,27. Unsere Daten zeigen, dass TTBK2 und primäre Zilien keine große Rolle bei der Regulierung undifferenzierter hPSCs spielen. Zur Unterstützung unserer Beobachtung konnte die Aktivierung des HH-Signalwegs die spontane Differenzierung von hPSCs nach dem FGF2-Entzug nicht verhindern28. Obwohl wir den Einfluss spezifischer Kulturbedingungen nicht vollständig ausschließen können, kommen wir zu dem Schluss, dass hPSCs, denen primäre Zilien fehlen, effizient vermehrt werden können, ohne dass sich die Morphologie einzelner Kolonien oder die Expression von Pluripotenzmarkern nennenswert verändert. Bei der Fertigstellung dieses Manuskripts wurden ähnliche Ergebnisse mit KIF3A/KIF3B-Knockout-hPSCs32 oder TTBK2-Knockout-iPSCs41 berichtet.

Warum sollten hPSCs also ihre Ressourcen in den Aufbau des primären Ziliums investieren, wenn dieses Organell in diesem bestimmten Zellstadium nicht entscheidend ist? Wir spekulieren, dass das Vorhandensein primärer Zilien im undifferenzierten Zellzustand die spätere Ausführung eines spezifischen Differenzierungsprogramms erleichtern könnte. In gewisser Weise ähnelt dies konzeptionell möglicherweise dem Gleichgewichtszustand vieler Genpromotoren in hPSCs und ermöglicht so anschließend eine effiziente Reaktion auf geeignete Reize44.

Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Ablation primärer Zilien in hPSCs zu einem ähnlichen Phänotyp führt wie die Aktivierung des HH-Signalwegs – einer vergrößerten Größe der Neuralrosette. Diese Beobachtung steht im Einklang mit einer unterschiedlichen Abhängigkeit einzelner HH-Aktivatoren und -Inhibitoren vom Vorhandensein primärer Zilien. Interessanterweise wurde zwar über verschiedene HH-„Funktionsgewinn“-Phänotypen nach der Zerstörung der primären Zilien berichtet4, der Verlust primärer Zilien aufgrund der TTBK2-Ablation im Neuralrohr bei Mäusen wurde jedoch interessanterweise mit HH-„Funktionsverlust“-Defekten in Verbindung gebracht8. Darüber hinaus führte eine Störung der Ciliogenese in embryonalen OFD1-KO-Stammzellen der Maus zu einer verringerten Aktivierung des HH-Signalwegs im Verlauf der neuronalen Differenzierung. Es muss noch geklärt werden, welche Faktoren solchen Unterschieden zwischen Maus- und menschlichen Zellen zugrunde liegen. Interessanterweise wurde in neueren Arbeiten postuliert, dass von hPSCs abgeleitete Neuralrosetten durch einen Mechanismus der sekundären Neurulation gebildet werden, der bei Mäusen auf die am weitesten kaudalsten Teile des sich entwickelnden Neuralrohrs beschränkt ist34.

Es wurde vorgeschlagen, dass primäre Zilien für die Umwandlung von hPSCs in PAX6 + neurale Vorläuferzellen und damit für den Erwerb des neuralen Schicksals von wesentlicher Bedeutung sind30. Unsere Daten stellen ein solches Modell in Frage und legen nahe, dass TTBK2 und primäre Zilien für den Erwerb des Schicksals von PAX6 + neuronalen Vorläufern während der hPSC-Differenzierung nicht entscheidend sind. Stattdessen scheinen primäre Zilien die Proliferation neuraler Vorläufer im Neuralrosettenstadium zu regulieren. Diese Beobachtung steht im Einklang mit einer berichteten Akkumulation von SOX2 + neuronalen Vorläufern in KIF3A- und KIF3B-KO-hPSCs32 und mit dem Fehlen früher Neurodifferenzierungsphänotypen bei Mäusen mit primären Ziliendefekten8,31,46. Darüber hinaus könnte angesichts der jüngsten Fortschritte bei der Entwicklung von Inhibitoren von TTBK1/241,47 die zeitliche Ablation primärer Zilien genutzt werden, um die Ausbeute von Neurodifferenzierungsprotokollen zu optimieren.

TTBK1 und TTBK2 weisen in ihren Kinasedomänen fast 60 % Identität und 70 % Ähnlichkeit auf, was sie zu den engsten Verwandten innerhalb der CK1-Kinase-Familie macht13. Frühere Daten, einschließlich unserer eigenen, haben gezeigt, dass TTBK2 für die Bildung primärer Zilien in mehreren Systemen essentiell ist – keine andere Kinase schien in der Lage zu sein, einen vollständigen Verlust von TTBK28,42 zu kompensieren. Ebenso zeigen unsere aktuellen Daten, dass die Ablation von TTBK2 in undifferenzierten hPSCs zu einem vollständigen Verlust der primären Zilien führt. Interessanterweise deuten unsere Ergebnisse jedoch darüber hinaus darauf hin, dass TTBK1 das Fehlen von TTBK2 in von hPSCs abgeleiteten neuralen Rosetten teilweise kompensieren kann. Dies ist ziemlich überraschend, da das prolinreiche Motiv, das an der TTBK2-CEP164-Interaktion9,48,49 und damit an der Rekrutierung der Kinase zum Mutterzentriol beteiligt ist, in TTBK1 schlecht konserviert ist (Suppl. Abb. 4D). Eine plausible Erklärung ist, dass die Konzentration der Kinaseaktivität am Mutterzentriol für die effiziente Phosphorylierung ihrer Schlüsselsubstrate nicht unbedingt erforderlich ist, vorausgesetzt, dass die Konzentrationen und die Aktivität der Kinase außerhalb des Mutterzentriols ausreichend hoch sind. Tatsächlich weisen undifferenzierte hPSCs niedrige TTBK1-Spiegel auf, die nicht ausreichen, um einen nennenswerten Beitrag zur primären Zilienassemblierung zu leisten. Im Gegensatz dazu wird die TTBK1-Expression während der Bildung neuronaler Rosetten deutlich hochreguliert, und folglich wird TTBK1 kompetent, die Ciliogenese zu beeinflussen. Wichtig ist, dass unser Rettungsexperiment mit vorübergehender TTBK1-Transfektion einen Konzeptnachweis dafür darstellt, dass TTBK1 in der Lage ist, primäre Zilien zu regulieren. Unser Modell ist auch im Hinblick auf TTBK2-Frame-Shift-Mutationen attraktiv, die mit spinozerebellärer Ataxie 1150 assoziiert sind. Hier fehlt den resultierenden verkürzten Proteineinheiten das C-terminale CEP164-Bindungsmotiv und sie gelten daher als nicht in der Lage, die Ciliogenese zu unterstützen8,51. Darüber hinaus entwickeln sich primäre Zilien zu entscheidenden Regulatoren der ZNS-Funktionalität52,53,54. Angesichts der Tatsache, dass TTBK1 als plausibles therapeutisches Ziel für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit (AD)47,55,56,57 gilt, könnte seine direkte Beteiligung an der primären Zilienregulation diese Bemühungen bei der AD-Targeting erheblich behindern. Zukünftige Studien sollten daher untersuchen, in welchen Zelltypen TTBK1 die Ciliogenese regulieren kann und welchen genauen Wirkungsmechanismus es hat.

CCTL14-Zellen (https://hpscreg.eu/cell-line/MUNIe007-A) wurden im undifferenzierten Zustand als Feeder-freie Monoschicht auf Matrigel (Corning)-beschichtetem Kunststoff in täglich gewechseltem MEF-konditioniertem hESC-Medium (DMEM) kultiviert /F12, 15 % Knockout-Serumersatz (beide von Gibco), 2 mM L-Glutamin, 1 × nichtessentielle Aminosäuren (NEAA) (beide von Biosera), ½x Zell Shield (Minerva Biolabs), 100 µmol/L β-Mercaptoethanol ( Sigma-Aldrich) und 10 ng/ml hFGF2 (Invitrogen)). Das konditionierte Medium wurde vor der Verwendung mit 2 mM L-Glutamin, 1/2x Zell Shield und 10 ng/ml hFGF2 angereichert. iPSC Neo1 w1-Zellen40 wurden undifferenziert kultiviert Zustand als Feeder-freie Monoschicht auf Matrigel (Corning)-beschichtetem Kunststoff in täglich gewechseltem komplettem mTeSR-Medium (StemCell Technologies) mit ½x Zell Shield. Die Zellen wurden regelmäßig mit Tryple Express (Thermo Fisher Scientific) passagiert. Wo angegeben, wurden undifferenzierte Zellen behandelt mit 500 nM SAG (Sigma) auf D1 und D2 nach der Aussaat und analysiert auf D3. i3N-Zellen wurden gehalten und differenziert, wie ausführlich in 58 beschrieben. hTERT-RPE-1-KOs wurden wie zuvor beschrieben in DMEM/F12, 10 % FBS und 2 mM L-Glutamin kultiviert42.

Für transiente Transfektionsexperimente wurden TTBK2-KO-Zelllinien auf Glasdeckgläsern (Matrigel-beschichtet für hPSCs) ausgesät und am nächsten Tag mit 0,5 µg menschlichem TTBK1-HaloTag®-ORF in pFN21A (FHC12512, Promega) oder pglap1-TTBK2 („GFP- TTBK2“42) mit Lipofectamine 3000 (Invitrogen). Das Medium wurde 4 Stunden nach der Transfektion gegen frisches Kulturmedium ausgetauscht. Um die Ciliogenese zu fördern, wurde hTERT RPE-1 24 Stunden nach der Transfektion für 24 Stunden in serumfreiem DMEM/F12 mit 2 mM L-Glutamin ausgehungert. Zur Quantifizierung wurden pro Bedingung und Experiment mindestens 40 transfizierte Zellen analysiert.

Die Zellen wurden in einer Dichte von 4000–6000 Zellen/cm2 in einem vollständigen Wachstumsmedium mit 20 μM ROCK1-Inhibitor Y-27632 (Selleckchem) ausgesät. Am nächsten Tag (D1) wurde das Medium gegen Rosetten-Differenzierungsmedium (DMEM/F12:Neurobasal 1:1 (beide von Gibco), N2, B27 mit Vitamin A (beide von ThermoFisher), 2 mM L-Glutamin, 1 × NEAA ausgetauscht , ½x Zell Shield) mit 20 μM Y-27632 und 20 μM TGF-β-Inhibitor SB 431542 (Sigma). Wo angezeigt, begann die Behandlung mit 5 nM SAG (Sigma) am Tag 1. An Tag 4 wurde das Medium gegen Rosetten-Differenzierungsmedium (ohne Inhibitoren) ausgetauscht, bis Tag 9 wurde das Medium täglich gewechselt. Um D6 herum begannen Rosetten zu erscheinen. Für das frühe Stadium des Differenzierungsexperiments (Abb. 1A) wurden die Zellen auf D9 fixiert/geerntet. Für spätere Stadien der neuronalen Rosettendifferenzierung (Abb. 1D) wurden Rosettencluster auf D9 ausgeschnitten und mit frischem Rosettendifferenzierungsmedium auf eine Matrigel-beschichtete Platte übertragen (zur Immunfärbung wurden Glasdeckgläser in die Vertiefungen eingesetzt und mit Matrigel beschichtet). Am Tag 10 wurde das Medium gewechselt und an den angegebenen Stellen 5 nM SAG hinzugefügt. Die Hälfte des Mediumvolumens (mit Vehikel/SAG) wurde bis zum 15. Tag täglich ausgetauscht. Wo angegeben, wurden Rosettenkulturen täglich von Tag 12 bis Tag 15 mit TTBK1/2-Inhibitor (1 µM) (Geschenk von Alison Axtman41) behandelt.

Phasenkontrastbilder differenzierter Rosetten wurden auf D15 mit dem inversen Mikroskop LEICA DM IL LED aufgenommen, das mit der Kamera Leica DFC295 (Leica Microsystems), der Leica Application Suite (LAS) Version 3.8.0 und dem Objektiv HI PLAN I 10x/0,22 ausgestattet war. Das Freihand-Auswahltool in Fidschi (Version 2.1.059) wurde verwendet, um den äußeren Rand der Rosette zu umreißen, und der Bereich innerhalb des ausgewählten Umrisses wurde als Rosettenbereich gemessen.

Zur Zilienfärbung wurden die Kulturen mit Methanol bei –20 °C fixiert, in PBS gewaschen, in Blockierungspuffer (1 % BSA in PBS) blockiert und 1 Stunde/RT oder über Nacht/4 °C mit den folgenden primären Antikörpern in Blockierung gefärbt Puffer: ARL-13B (Kaninchen, 17711-1-AP, Proteintech, 1:1000), ARL13B (Maus, sc-515784, Santa-Cruz, 1:200), γ-Tubulin (Maus, T6557, Sigma, 1: 1000), TTBK1 (Maus, HPA031736, Sigma, 1:500), TTBK2 (Kaninchen, HPA018113, Sigma, 1:500), Halo-Tag (Maus, 28a8 ChromoTek, 1:200), Alexa Fluor 647-direkt markiertes CETN1 (Kaninchen, 12794-1-AP, Proteintech/ A20186, Invitrogen, 1:50). Für neurale Rosettenmarker und PhosphoH3-Färbung wurden die Kulturen in 4 % PFA 20 Minuten/4 °C fixiert, 2 × in PBS gewaschen, in 0,2 % Triton-X100 in PBS 5 Minuten/RT permeabilisiert und 1 Stunde/Minute gefärbt. RT oder über Nacht/4 °C mit folgenden primären Antikörpern in 0,2 % Triton-X100 in PBS: PAX6 (Kaninchen, #60433, Cell Signaling, 1:300), ZO-1-1A12 (Maus, 33–9100, Invitrogen , 1:800), Phospho-Histone H3 Thr11 (Kaninchen, #9764 Cell Signaling, 1:300). Die Deckgläser wurden dann 3 × 5 Minuten in PBS gewaschen und mit von Eseln gezüchteten Sekundärantikörpern entweder in Blockierungspuffer oder 0,2 % Triton-X100 in PBS, 1 Stunde/RT, angefärbt: Anti-Maus oder Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488, 568 oder 647 (alle Invitrogen, 1:1000). Die Kerne wurden mit DAPI oder Hoechst 5 Min./RT gefärbt. Nach dem Waschen wurden die Deckgläser mit Glycergel (Agilent) oder ProLong™ Glass Antifade Mountant (Invitrogen) befestigt.

Z-Stapel-Bilder wurden mit Zeiss AxioImager.Z2 mit der Hamamatsu ORCA Flash 4.0-Kamera unter Verwendung eines 40x/1,3 Plan Apochromat OIL- oder 63x/1,4 Plan-Apochromat OIL-Objektivs, gesteuert durch Zen Blue Software, aufgenommen.

Z-Schnitte wurden in einer Ebene durch Z-Projektion mit maximaler Intensität projiziert, ein Farbkompositbild wurde in Fidschi erstellt. Um die Menge der Zilien abzuschätzen (eine hohe Dichte der Zilien im Rosettenlumen erschwert das Zählen ihrer genauen Anzahl), haben wir den ARL13B-positiven Rosettenflächenanteil gemessen (definiert als % der Rosettenfläche mit ARL13b-Signal, in den Abbildungen als „relative Zilien“ bezeichnet). ). In Fidschi wurde ein Freihand-Auswahltool verwendet, um die Außenränder der Rosetten zu skizzieren, die dann dem ROI-Manager hinzugefügt wurden. Das Bild wurde in separate Farbkanäle aufgeteilt und in dem Kanal, in dem das ARL13B-Signal erfasst wurde, wurde eine Schwellenwertmaske angewendet und manuell angepasst, um den Bereich mit den ARL13B-gefärbten Zilien darzustellen. Für jede analysierte Rosette wurde dann der Anteil der Rosette (%) bestimmt, der von der Maske bedeckt war. Um die Proliferation der Zellen in Rosetten zu quantifizieren, zählten wir Phosphohiston3 (pH3)-positive Zellen pro Rosette. Das Freihand-Auswahlwerkzeug in Fidschi wurde erneut verwendet, um die Außenränder der Rosette zu skizzieren. Die pH3-positiven Zellen innerhalb des ausgewählten Umrisses wurden manuell gezählt und ein Verhältnis der pH3-Zellenzahl zur Rosettenfläche ermittelt.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem RNA-Blue-Reagenz gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert. 0,3–1 μg RNA wurden für die cDNA-Synthese unter Verwendung des Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) verwendet. 2 μl 8 × verdünnte cDNA wurden in 10 μl qPCR-Reaktionen mit LightCycler® 480 SYBR Green I Master mit den in Tabelle 1 aufgeführten Primern gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet und in Echtzeit mit LightCycler® 480 Instrument II (Roche) überwacht. Die relative Genexpression wurde unter Verwendung der 2−ΔΔCq-Methode berechnet; Als Referenzgen wurde GAPDH verwendet.

Die Proteinexpression wurde durch Western Blot wie zuvor beschrieben analysiert40. Kurz gesagt, die Zellen wurden in SDS-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 % Glycerin, 1 % SDS) lysiert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem DC Protein Assay Kit (Bio-Rad) gemessen und eine gleiche Proteinmenge in 8 %iges Gel geladen. Die folgenden Primärantikörper wurden verwendet: TTBK2 (Kaninchen, HPA018113, Sigma, 1:250), NANOG (Kaninchen, #3580, Cell Signaling, 1:1000), OCT4 (Maus, SC-5279, Santa Cruz, 1:4000) Als Beladungskontrolle wurde α-TUBULIN (Maus, 6631–1 Proteintech, 1:2000) verwendet. Um das Signal zu erkennen, wurden sekundäre HRP-konjugierte Antikörper gegen Kaninchen (#7074, Cell Signaling, 1:3000) oder Anti-Maus (A4461, Sigma, 1:3000) verwendet. Das Chemilumineszenzsignal wurde mit ECL Prime (GE Healthcare) und dem ChemiDoc Imaging System (BioRad) ermittelt.

Die relative Wachstumsrate wurde mithilfe eines Kristallvioletttests wie zuvor beschrieben40 bestimmt. Kurz gesagt, die Zellen wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät und ab D1 mit Schein- oder SAG (500 nM) behandelt. Die Kulturen wurden auf D1-6 in 4 % Formaldehyd fixiert, mit PBS gewaschen und in 0,5 % Kristallviolett inkubiert (1 Stunde). Nach dreimaligem Waschen mit H2O wurden sie in 33 %iger Essigsäure inkubiert (20 Min./Schütteln). Das relative Wachstum wurde als Anstieg der Absorption bei 570 nm bestimmt.

TTBK2-gRNA42, kloniert in den pSpCas9 (BB)-2A-GFP-Vektor oder das Vehikel, wurde wiederholt in die CCTL14-Linie transfiziert, wie zuvor beschrieben60. Der pSpCas9(BB)-2A-GFP-Vektor war ein Geschenk von Feng Zhang (https://www.addgene.org/4813861). GFP-positive Zellen wurden unter Verwendung von BD FACS ARIA II nach Matrigel-beschichteten 96-Well-Platten sortiert. Ausgewählte Klone wurden durch Immunfärbung auf das Vorhandensein von TTBK2 überprüft, expandiert und sequenziert, um die Störung des TTBK2-Locus zu überprüfen.

Für die Visualisierung der TTBK1- und TTBK2-Sequenzausrichtung wurde die Jalview-Software (Version 2.11.2.5)62 verwendet.

Quantitative Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Sofern relevant, werden einzelne Datenpunkte angezeigt, um die Stichprobengröße jedes analysierten Zustands zu veranschaulichen (Abb. 1F, H, 3B, E, G, 4C und D: ein Punkt – eine analysierte Rosette; Abb. 2A: ein Punkt – % von Flimmerzellen pro Bild (40 Zellen pro Bild, 6 Bilder); Abb. 2E: ein Punkt – % der Flimmerzellen in einem ROI von 20 Zellen (mehrere ROIs pro Bild wurden gemessen). Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch t-Test ausgewertet oder eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Holm-Sidaks oder Tukeys Mehrfachvergleichstests. Für alle statistischen Analysen wurde ein P-Wert < 0,05 als signifikant angesehen (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001). Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism (GraphPad Software; www.graphpad.com) durchgeführt. Alle Experimente wurden mindestens dreifach durchgeführt (n = Anzahl der biologischen Replikate), sofern nicht anders angegeben .

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Alison Axtman, Jan Raška und Tomáš Bárta für die Weitergabe von Reagenzien oder Proben, Tomáš Loja für die Hilfe bei FACS und Hana Hříbková mit Dáša Bohačiaková für Ratschläge zum Differenzierungsprotokoll für neuronale Rosetten. Die Arbeit wurde durch Zuschüsse der Tschechischen Wissenschaftsstiftung (22-13277S) und der Medizinischen Fakultät (MUNI/11/SUP/03/2022) an LC unterstützt. Wir danken der Kerneinrichtung CELLIM, die vom großen RI-Projekt Czech-BioImaging unterstützt wird ( LM2018129, finanziert von MEYS CR) für ihre Unterstützung bei der Beschaffung der in diesem Artikel vorgestellten wissenschaftlichen Daten.

Labor für Zilien- und Zentrosomenbiologie, Abteilung für Histologie und Embryologie, Medizinische Fakultät, Masaryk-Universität, Kamenice 3, 62500, Brünn, Tschechische Republik

Lucia Binó & Lukáš Čajánek

Abteilung für Tierphysiologie und Immunologie, Abteilung für Experimentelle Biologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Masaryk-Universität, Kamenice 5, 62500, Brünn, Tschechische Republik

Lukáš Čajánek

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LB – führte Experimente durch und analysierte Daten, LC – konzipierte und überwachte das Projekt und schrieb zusammen mit LB die Arbeit.

Korrespondenz mit Lukáš Čajánek.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Binó, L., Čajánek, L. Tau-Tubulinkinase 1 und 2 regulieren die Ciliogenese und aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gewonnene neurale Rosetten. Sci Rep 13, 12884 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39887-9

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Eingegangen: 27. Februar 2023

Angenommen: 01. August 2023

Veröffentlicht: 09. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39887-9

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